LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS
Į S A K Y M A S
DĖL KRAKMOLO, BALTYMINGUMO, PEPSINU IR DRUSKOS RŪGŠTIMI IŠTIRPINAMŲ ŽALIŲ BALTYMŲ, LAISVOJO IR SUMINIO GOSIPOLIO, TILOZINO, VIRGINIAMICINO KIEKIO NUSTATYMO PAŠARUOSE IR PEPSINO AKTYVUMO ĮVERTINIMO TECHNINIO REGLAMENTO
2000 m. birželio 30 d. Nr. 212
Vilnius
Vykdydamas Pašarų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 34-952) nuostatas bei siekdamas įgyvendinti Lietuvos pasirengimo narystei Europos Sąjungoje programos (Nacionalinės Acquis programos) Teisės derinimo ir Acquis įgyvendinimo priemonių 2000 metams planus, patvirtintus Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2000 m. balandžio 10 d. nutarimu Nr. 409 (Žin., 2000, Nr. 31-869):
1. Tvirtinu Krakmolo, baltymingumo, pepsinu ir druskos rūgštimi ištirpinamų žalių baltymų, laisvojo ir suminio gosipolio, tilozino, virginiamicino kiekio nustatymo pašaruose ir pepsino aktyvumo įvertinimo techninį reglamentą (pridedama).
Patvirtinta
Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro
2000 06 30 įsakymu Nr. 212
krakmolo, baltymingumo, pepsinu ir druskos rūgštimi ištirpinamų žalių baltymų, laisvojo ir suminio gosipolio, tilozino, virginiamicino kiekio pašaruose nustatymo ir pepsino aktyvumo įvertinimo techninis reglamentas
(Parengtas pagal 1972 m. balandžio 27 d. trečiąją Europos Komisijos direktyvą 72/199/EEC „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“ ir jos pataisymus: 1981 m. rugpjūčio 29 d. direktyvą 81/680/EEC, 1984 m. sausio 18 d. direktyvą 84/4/EC, 1993 m. birželio 4 d. direktyvą 93/28/EC, 1994 m. kovo 1 d. direktyvą 94/103(51)/EEC, 1998 m. liepos 24 d. direktyvą 98/54/EC ir 1999 m. liepos 27 d. direktyvą 1999/79/EC.)
I. Bendrosios nuostatos
1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminių analizių metodus. Šie atvejai metodų aprašymuose pateikiami su nuoroda „Pastabos“).
2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, tuomet, jei nenurodyta kitaip, metodą pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau taikomas metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate.
3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija.
II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai
5. Šiame techniniame reglamente ir metodų aprašymuose vartojamos sąvokos:
Žalių baltymų kiekis – suminis azotinių junginių kiekis, apskaičiuojamas Kjeldahl metodu, nustatyto azoto kiekį dauginant iš koeficiento 6,25, kaip nurodyta šio techninio reglamento 2 priede.
Suminis gosipolio kiekis – laisvojo ir susijungusio su baltymais gosipolio bei jam giminingų medžiagų kiekis nustatomas šio techninio reglamento 5 priede nurodytu metodu.
Pepsinu ir druskos rūgštimi ištirpinami žali baltymai – dalis žalių baltymų, kurie šio techninio reglamento 3 priede apibrėžtomis sąlygomis tirpsta pepsino druskos rūgšties tirpale ir nustatomi 3 priede aprašytu metodu.
6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių ir medžiagų trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai:
2-propanolis – (ch3)2choh;
3-amino-1-propanolis – NH2(CH2)3OH;
acetanilidas – N-fenilacetamidas; CH3CONHC6H5;
acto rūgštis – etano rūgštis; CH3COOH;
anilinas – fenilaminas; c6h5nh2;
cinko acetatas dihidratas – cinko bis(etanoatas) dihidratas; Zn(CH3COO)2 × 2H2O;
dikalio – vandenilio fosfatas – dikalio-vandenilio tetraoksofosfatas; K2HPO4;
dimetilformamidas – dimetilmetanamidas; (ch3)2ncho;
druskos rūgštis – vandenilio chloridas; HCl;
etanolis – C2H5OH;
gliukozė – C6H12O6;
gosipolis – 2,2-bi(8-formil-1,6,7-trihidroksi-5-izopropil-3-metilnaftalenas); C30H30O8;
gosipolio acetatas – 2,2-bi(8-formil-1,6,7-trihidroksi-5-izopropil-3-metilnaftalenas)-etano rūgštis; C30H30O8×C2H4O2;
heksanas – H(CH2)6H
kalio heksacianoferatas (II) trihidratas – K4Fe(CN)6× 3H2O;
kalio sulfatas – dikalio tetraoksosulfatas; K2SO4;
kalio-divandenilio fosfatas – kalio-divandenilio tetraoksofosfatas; (KH2PO4);
ličio sulfatas dihidratas – diličio tetraoksosulfatas dihidratas; Li2SO4 · 2H2O;
metanolis – CH3OH;
metilraudonasis – 4-dimetilaminoazobenzeno-2-karboksilo rūgštis; C15H15N3O2;
natrio chloridas – NaCl;
natrio hidroksidas – NaOH;
natrio molibdatas dihidratas – dinatrio tetraoksomolibdatas dihidratas; Na2MoO4 · 2H2O;
natrio volframatas dihidratas – dinatrio tetraoksovolframatas dihidratas; Na2WO4 · 2H2O;
pepsinas – E. C. 3.4.23.1;
sacharozė – C12H22O11;
sieros rūgštis – divandenilio tetraoksosulfatas; H2SO4;
tilozinas – C46H77NO17;
tirozinas – 2-amino-3-(4-hidroksifenil)propano rūgštis; HOC6H4CH2CH(NH2)COOH;
trichloracto rūgštis – trichloretano rūgštis; CCl3COOH;
vario (II) oksidas – CuO;
vario sulfatas pentahidratas – vario tetraoksosulfatas pentahidratas; CuSO4 × 5H2O;
virginiamicinas – C28H35N3O7;
Tween 80 – polioksietileno [(-OCH2CH2-)n] ir gliucitolio monooleato (C24H49O7) mišinio prekinis pavadinimas.
III. Mėginių paruošimas cheminei analizei
8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos:
8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms:
8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal žemės ūkio ministro įsakymu patvirtintus pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo metodus;
8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu:
8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypatingai jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reiktų įsitikinti, ar patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis;
8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga:
8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai išmaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau:
8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip. Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurių kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš sveriant cheminei analizei, mėginys vėl išmaišomas;
8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip. Mėginys džiovinamas siekiant sumažinti drėgnį iki 8% – 12% pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio reglamento 8.3.1.1 punkte;
8.3.1.3. skysti ir pusiau skysti pašarai. Mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas;
8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose.
8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose:
8.5.1. visi analitiniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas tuščiuoju bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas;
8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis;
8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška:
8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje taikytas metodas nurodomas analizės ataskaitoje;
8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą.
IV. Mėginių cheminė analizė
11. Pepsinu ir druskos rūgštimi ištirpinamų žalių baltymų kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 3 priede nurodytą metodą.
12. Pepsino, kuris naudojamas nustatant pepsinu ir druskos rūgštimi ištirpinamų žalių baltymų kiekį, aktyvumas nustatomas taikant šio techninio reglamento 4 priede nurodytą metodą.
13. Laisvojo gosipolio, suminio gosipolio ir chemiškai giminingų medžiagų kiekis medvilnės sėklose, medvilnės sėklų miltuose ir išspaudose bei kombinuotuose pašaruose, kuriuose šių medžiagų yra daugiau kaip 20 mg/kg, nustatomas taikant šio techninio reglamento 5 priede nurodytą metodą.
14. Tilozino kiekis pašaruose, koncentratuose ir premiksuose nustatomas matuojant difuziją agare, taikant šio techninio reglamento 6 priede nurodytą metodą.
1 priedas
KRAKMOLO KIEKIO NUSTATYMAS Poliarimetrinis metodas
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas krakmolo ir didelės molekulinės masės krakmolo skaidymosi produktų kiekis pašaruose, siekiant patikrinti, kaip laikomasi energijos vertinimo sistemos techninio reglamento ir pašarų klasifikatoriaus reikalavimų.
2. Metodo esmė
Metodas susideda iš dviejų matavimų. Pirmuoju atveju mėginys veikiamas karšta praskiesta druskos rūgštimi. Po to tirpalas skaidrinamas, filtruojamas ir matuojamas per jį pereinančios poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas. Antruoju atveju mėginys ekstrahuojamas 40 % etanoliu. Filtratas rūgštinamas druskos rūgštimi, nuskaidrinamas, filtruojamas ir matuojamas per jį pereinančios poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas.
Skirtumas tarp dviejų matavimų, padaugintas iš žinomo koeficiento, rodo krakmolo kiekį mėginyje.
3. Reagentai:
3.2. 1,128% (m/v) druskos rūgšties tirpalas.
Koncentracija turi būti patikrinta titruojant 0,1 mol/l natrio hidroksido tirpalu, įlašinus 0,1 % (m/v) metilraudonojo tirpalo 94% (v/v) etanolyje. 10 ml = 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH;
3.3. Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato dihidrato, Zn(CH3COO)2 × 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Vandeniu praskiedžiama iki 100 ml;
3.4. Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II) trihidrato, K4Fe(CN)6× 3H2O. Vandeniu praskiedžiama iki 100 ml;
4. Prietaisai:
5. Matavimas
5.1. Mėginio paruošimas:
Mėginys susmulkinamas taip, kad persisijotų per sietą su apvaliomis 0,5 mm skersmens akutėmis.
5.2. Suminio poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimo (P ir S) nustatymas (žr. 1 pastabą).
1 mg tikslumu pasveriama 2,5 g mėginio, kuris supilamas į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama 25 ml druskos rūgšties tirpalo (3.2), purtoma, kad mėginys tolygiai pasiskirstytų, ir dar įpilama 25 ml druskos rūgšties tirpalo (3.2). Kolba įmerkiama į verdančio vandens vonią, pirmąsias tris minutes stipriai ir visą laiką purtoma, kad nesusidarytų aglomeratų. Vandens kiekis vonioje turi būti pakankamas, kad įmerkus į ją matavimo kolbą vanduo nenustotų viręs. Purtant kolbą, jos negalima išimti iš vonios. Lygiai po 15 minučių kolba išimama iš vonios, įpilama 30 ml šalto vandens ir tuoj pat aušinama iki 20 oC.
Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (3.3) ir purtoma vieną minutę. Paskui įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (3.4) ir vėl purtoma vieną minutę. Praskiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma ir filtruojama. Jei filtratas nėra idealiai skaidrus (taip pasitaiko retai), nustatymas pakartojamas naudojant daugiau Carrez I ir II tirpalų, pvz., 10 ml.
200 mm ilgio vamzdyje poliarimetru arba sacharimetru matuojama, kokiu kampu tirpalas suka poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumą.
5.3. 40% etanolyje tirpių medžiagų poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimo (P' ir S') nustatymas
1 mg tikslumu pasveriama 5 g mėginio, kuris supilamas į 100 ml matavimo kolbą ir įpilama apie 80 ml etanolio (3.5) (žr. 2 pastabą). Kolba laikoma vieną valandą kambario temperatūroje; per tą laiką šešis kartus kolba stipriai supurtoma, kad mėginys gerai susimaišytų su etanoliu. Praskiedžiama iki žymės etanoliu (3.5), sumaišoma ir filtruojama.
50 ml filtrato (atitinka 2,5 g mėginio) įpilama į 250 ml Erlenmeyer kolbą, įpilama 2,1 ml druskos rūgšties tirpalo (3.1) ir stipriai purtoma. Prie Erlenmeyer kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius, kolba įmerkiama į verdančio vandens vonią. Lygiai po 15 minučių Erlenmeyer kolba išimama iš vonios, jos turinys supilamas į 100 ml matavimo kolbą, skalaujant Erlenmeyer kolbą trupučiu šalto vandens, ir aušinama iki 20 oC.
Skaidrinama, naudojant Carrez I (3.3) ir II (3.4) tirpalus, skiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma, filtruojama ir matuojamas poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas, kaip nurodyta 5.2 punkto antroje ir trečioje pastraipose.
6. Rezultatų skaičiavimas
Procentinis krakmolo kiekis mėginyje skaičiuojamas taip:
6.1. Matuojant poliarimetru:
,
kur:
P – suminis poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas laipsniais;
P' – poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas 40 % etanolyje tirpių medžiagų tirpalu laipsniais;
– savitasis gryno krakmolo tirpalo poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas. Visuotinai priimtos
–
–
–
–
– vertės yra:
+ 185,9o ryžių krakmolo;
+ 195,4o bulvių krakmolo;
+ 184,6o kukurūzų krakmolo;
+ 182,7o kviečių krakmolo;
+ 181,5o miežių krakmolo;
+ 181,3o avižų krakmolo;
+ 184,0o kitų rūšių krakmolo, taip pat krakmolų mišinių kombinuotuose pašaruose.
6.2. Matuojant sacharimetru:
 |
,
kur:
S – suminis poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas, sacharimetro laipsniais;
S' – poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas 40 % etanolyje tirpių medžiagų tirpalu, sacharimetro laipsniais;
N – sacharozės masė g/100 ml vandens, kai 200 mm ilgio vamzdyje poliarizuotos šviesos plokštuma pasukama 100o sacharimetro laipsnių:
16,29 g prancūziškiems sacharimetrams,
26,00 g vokiškiems sacharimetrams,
20,00 g kitiems sacharimetrams.
|
– savitasis gryno krakmolo tirpalo poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimas (žr. 6.1 punktą).
PASTABOS:
1. Jei mėginyje yra daugiau kaip 6% karbonatų, skaičiuojamų kaip kalcio karbonatas, jie prieš suminio poliarizuotos šviesos poliarizacijos plokštumos sukimo matavimą turi būti suardomi tiksliai reikalingu praskiestos sieros rūgšties kiekiu;
2. Jei produkte yra daug laktozės, pvz., pieno miltelių serume ar lieso pieno milteliuose, įpylus 80 ml etanolio (3.5), daroma taip: prie kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir kolba 30 minučių įmerkiama į 50 oC temperatūros vandens vonią. Kolba paliekama ataušti ir analizė tęsiama 5.3 punkte nurodytu būdu.
3. Toliau išvardytos pašarinės medžiagos, jei jų kiekiai pašaruose yra nemaži, kaip žinoma, sukelia trukdžius nustatant krakmolo kiekį poliarmetriniu metodu ir tai gali duoti neteisingus rezultatus:
– (cukrinių) runkelių produktai, tokie kaip (cukrinių) runkelių išspaudos, (cukrinių) runkelių melasa, (cukrinių) runkelių žlaugtai, (runkelių) cukrus;
– citrusų išspaudos;
– linų sėmenys, sėmenų išspaudos, sėmenų rupiniai;
– rapsų sėklos, rapsų išspaudos, rapsų rupiniai, rapsų luobelės;
– saulėgrąžų sėklos, saulėgrąžų rupiniai, iš dalies išlukštentų saulėgrąžų rupiniai;
– kokoso riešutų branduolių išspaudos, kokoso riešutų branduolių rupiniai;
– bulvių išspaudos;
– džiovintos mielės;
– produktai, kuriuose yra daug inulino (pvz., saldžiųjų bulvių griežiniai ir miltai);
– riebalai.
______________
2 priedas
baltymingumo nustatymas KJELDAHL METODU
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas žalių baltymų kiekis pašaruose pagal azoto kiekį.
2. Metodo esmė
Mėginys sudeginamas sieros rūgštyje naudojant katalizatorių. Rūgštus tirpalas natrio hidroksido tirpalu pašarminamas. Amoniakas išdistiliuojamas ir surenkamas žinomame sieros rūgšties, kurios perteklius titruojamas standartiniu natrio hidroksido tirpalu, kiekyje.
3. Reagentai:
3.7. indikatorius metilraudonasis: 300 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio, 95% – 96% (v/v);
4. Prietaisai:
Prietaisai, tinkantys drėgnajam sudeginimui, distiliacijai ir titravimui Kjeldahl metodu.
5. Matavimas:
5.1. Drėgnasis sudeginimas
0,001g tikslumu pasveriama 1 g mėginio, sudedama į drėgnojo sudeginimo prietaiso kolbą. Įberiama 15 g kalio sulfato (3.1) ir katalizatoriaus kiekis (3.2) (atitinkamai 0,3 g–0,4 g vario oksido, arba 0,9 g–1,2 g vario sulfato), įpilama 25 ml sieros rūgšties (3.4) ir įmetama keletas pemzos granulių (3.11). Sumaišoma. Kolba iš pradžių kaitinama nestipriai, prireikus pasukama, kol masė suanglėja ir dingsta putos; toliau kaitinama intensyviau, kol tirpalas ima pastoviai virti. Kaitinimas yra pakankamas, jei verdanti rūgštis kondensuojasi ant kolbos sienelių. Reikia saugoti, kad neperkaistų šoninės kolbos sienos ir prie jų nepriliptų organinių medžiagų dalelių. Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias, virinama dar 2 valandas, paliekama ataušti.
5.2. Distiliacija
Atsargiai įpilama pakankamas kiekis vandens, kad visiškai ištirptų sulfatai. Paliekama ataušti, po to pridedama keletas cinko granulių (3.3).
Atsižvelgiant į spėjamą azoto kiekį mėginyje, į distiliacijos aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (3.5) arba (3.6). Įlašinama keli lašai indikatoriaus metilraudonojo (3.7).
Deginimo kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus, kurio antgalis ne mažiau kaip per centimetrą įmerkiamas į skystį, esantį surinkimo kolboje (žr. 3 pastabą). Stengiantis išvengti amoniako nuostolių (žr. 1 pastabą), į deginimo kolbą lėtai supilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (3.8). Kolba kaitinama, kol nusidistiliuos amoniakas.
5.3. Titravimas
Sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamas natrio hidroksido tirpalu (3.9) arba (3.10), atsižvelgiant į naudotos sieros rūgšties koncentraciją, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas.
6. Rezultatų skaičiavimas:
Žalių baltymų kiekis apskaičiuojamas pagal šią formulę:
 |
,
kur:
V1 – NaOH tirpalo (3.9 arba 3.10) tūris mililitrais, sunaudotas mėginio titravimui;
V0 – NaOH tirpalo (3.9 arba 3.10) tūris mililitrais, sunaudotas tuščiojo bandymo titravimui;
c – NaOH (3.9 arba 3.10) koncentracija moliais litre;
m – mėginio masė gramais.
7. Metodo patikrinimas:
7.1. Pakartojamumas
Skirtumas dviejų rezultatų, gautų atlikus du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu mėginiu, turi neviršyti:
0,2 % absoliučia verte, kai žalių baltymų kiekis yra mažesnis kaip 20%;
1,0 % santykine verte didesnės vertės, kai žalių baltymų kiekis nuo 20% iki 40%;
0,4 % absoliučia verte, kai žalių baltymų kiekis yra didesnis kaip 40%.
PASTABOS:
1. Prietaisai gali būti rankiniai, pusiau rankiniai ar automatiniai. Jei reikia mėginį po deginimo perpilti distiliavimui, turi būti perpilama be nuostolių. Jei distiliavimo prietaiso kolba neturi lašinamojo piltuvo, natrio hidroksido tirpalas supilamas prieš pat kolbos prijungimą prie kondensatoriaus, skystį iš lėto pilant sienelėmis;
2. Jei deginys sutirštėja, matavimui rekomenduojamas didesnis sieros rūgšties (3.4) kiekis, nei nurodyta;
3 priedas
PEPSINU IR DRUSKOS RŪGŠTIMI IŠtirpINAMŲ žalių BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatoma ta dalis žalių baltymų, kurie tam tikromis sąlygomis tirpsta pepsine ir druskos rūgštyje. Metodas taikomas visiems pašarams.
2. Metodo esmė
Mėginys 48 valandas šildomas 40oC temperatūroje pepsino ir druskos rūgšties tirpale. Suspensija filtruojama ir filtrate esančio azoto kiekis nustatomas žalių baltymų kiekiui nustatyti taikomu metodu.
3. Reagentai:
3.3. pepsinas, kurio aktyvumas 2 U/mg: pepsino aktyvumas apibrėžtas 4 priede nurodytame metode ir turi būti nustatomas pagal šį metodą;
3.4. apie 0,2% (m/v) šviežiai paruoštas pepsino tirpalas druskos rūgštyje (3.2); aktyvumas – 400 U/l;
4. Prietaisai:
5. Matavimas:
5.1. Tirpalo ruošimas (žr.2 pastabą)
1 mg tikslumu pasveriama 2 g mėginio ir supilama į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 450 ml pepsino tirpalo druskos rūgštyje (3.4), prieš tai pašildyto iki 40 oC, ir purtoma, kad turinys nesušoktų į gabalus. Stebima, kad suspensijos pH būtų mažesnis kaip 1,7. Kolba statoma į vandens vonią arba termostatą (4.1) ir laikoma 48 val. Supurtoma po 8 valandų, 24 valandų ir 32 valandų. Po 48 valandų įpilama 15 ml druskos rūgšties (3.1), aušinama iki 20oC, skiedžiama vandeniu iki žymės ir filtruojama.
5.2. Drėgnasis sudeginimas
Paimama 250 ml filtrato ir supilama į distiliavimo aparato (4.2) kolbą. Pridedami deginimui būtini reagentai, nurodyti baltymingumo nustatymo metodo 5.1 punkto antrame sakinyje. Sumaišoma ir užvirinama. Jei putoja, įlašinami keli lašai priešpučio emulsijos (3.5). Toliau intensyviai virinama, kol beveik visiškai išgaruoja vanduo. Kaitinimas sumažinamas ir atsargiai pašalinami paskutiniai vandens likučiai.
Kai tirpalas tampa skaidrus ir bespalvis (arba šviesiai žalias, jei naudojamas katalizatorius yra vario junginys), verdama dar vieną valandą. Paliekama ataušti.
5.3. Distiliuojama ir titruojama baltymingumo nustatymo metodo 5.2 ir 5.3 punktuose nurodyta tvarka.
6. Rezultatų skaičiavimas
6.1. Iš sieros rūgšties tirpalo tūrio, sunaudoto mėginiui titruoti, atimamas sieros rūgšties tirpalo tūris, sunaudotas tuščiajame bandyme. 1ml 0,05 mol/l sieros rūgšties tirpalo atitinka 1,4 mg azoto.
Azoto kiekis dauginamas iš koeficiento 6,25. Rezultatas išreiškiamas mėginio masės procentais.
6.2. Pakartojamumas
Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio bandymų rezultatų turi neviršyti:
0,4 % absoliučia verte, kai kiekiai yra mažesni kaip 20%;
2,0 % santykine verte, kai kiekiai yra ne mažesni kaip 20% ir ne didesni kaip 40%;
0,8 % absoliučia verte, kai kiekiai yra didesni kaip 40%.
4 priedas
PEPSINO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
1. Tikslas ir taikymo sritis
Metodu įvertinamas pepsino, kuris naudojamas nustatant pepsinu ir druskos rūgštimi ištirpinamų baltymų dalį, aktyvumas.
2. Metodo esmė
Tam tikromis sąlygomis hemoglobinas veikiamas pepsino tirpalu druskos rūgštyje. Hidrolizės nepaveikta baltymo dalis nusodinama trichloracto rūgštimi. Į filtratą įpilama natrio hidroksido ir Folin-Ciocalteau reagento. Matuojamas šio tirpalo optinis tankis, esant 750 nm bangos ilgiui, ir iš kalibracinės kreivės nustatomas atitinkamas tirozino kiekis.
3. Reagentai:
3.6. Folin-Ciocalteau reagentas. Į 2 litrų apvaliadugnę kolbą su standartine šlifo jungtimi įberiama 100 g natrio volframato dihidrato (Na2WO4 · 2H2O), 25 g natrio molibdato dihidrato (Na2MoO4 · 2H2O) ir įpilama 700 ml vandens. Įpilama 50 ml fosforo rūgšties (r = 1,71 g/ml) ir 100 ml koncentruotos druskos rūgšties (r = 1,19 g/ml), prie kolbos prijungiamas grižtamasis kondensatorius, tirpalas užverdamas ir iš lėto virinamas 10 valandų. Paliekama ataušti, atjungiamas grįžtamasis kondensatorius, įdedama 175 g ličio sulfato dihidrato (Li2SO4 · 2H2O), 50 ml vandens ir 1 ml bromo. Bromo pertekliui pašalinti virinama 15 minučių.
Tirpalas paliekamas ataušti, supilamas į 1 litro matavimo kolbą, skiedžiamas iki žymės vandeniu, sumaišomas ir filtruojamas. Neturi likti žalsvo atspalvio. Prieš naudojimą vienas tūris reagento skiedžiamas dviem tūriais vandens;
3.7. hemoglobino tirpalas: pasveriamas hemoglobino kiekis (apie 2 g baltymo, nustatyto pagal Anson), atitinkantis 354 mg azoto (žr.1 pastabą) ir supilamas į 200 ml kolbą su standartine šlifo jungtimi. Įpilama keli mililitrai druskos rūgšties tirpalo (3.2), kolba prijungiama prie vakuuminio siurblio ir purtoma, kol hemoglobinas visiškai ištirpsta. Vakuumas atjungiamas ir, toliau maišant, skiedžiama druskos rūgšties tirpalu (3.2) iki 100 ml. Ruošiama prieš pat naudojimą;
4. Prietaisai:
5. Matavimas:
5.1. Tirpalo ruošimas (žr. 2 pastabą)
150 mg pepsino ištirpinama 100 ml druskos rūgšties tirpalo (3.2). Į 50 ml matavimo kolbą pipete įpilama 2 ml šio tirpalo ir praskiedžiama iki žymės druskos rūgšties tirpalu (3.3). pH-metru patikrinta pH vertė turi būti 1,6 ± 0,1. Kolba dedama į vandens vonią (4.1).
5.2. Hidrolizė
5,0 ml hemoglobino tirpalo (3.7) įpilama į mėgintuvėlį, mėgintuvėlis vandens vonioje (4.1) pašildomas iki 25oC, įpilama 1 ml pagal 5.1 punktą gauto pepsino tirpalo ir tirpalas maišomas gale pastorinta stiklo lazdele, atliekant maždaug 10 judesių pirmyn ir atgal. Mėgintuvėlis paliekamas 25oC vandens vonioje lygiai 10 minučių, skaičiuojant nuo pepsino tirpalo pridėjimo (laikymo trukmės ir temperatūros turi būti griežtai laikomasi). Paskui įpilama 10,0 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.4), prieš tai pašildyto iki 25oC, sumaišoma ir filtruojama per sausą filtrą.
5.3. Spalvos išryškinimas ir optinio tankio matavimas
Į 50 ml Erlenmeyer kolbą pipete įpilama 5,0 ml filtrato, 10,0 ml natrio hidroksido tirpalo (3.5) ir nuolat purtant įpilama 3,0 ml praskiesto Folin-Ciocalteau reagento (3.6). Po 5–10 minučių spektrofotometru, esant 750 nm bangos ilgiui, matuojamas optinis tankis. Matavimams naudojamos 1 cm storio kiuvetės. Palyginamuoju tirpalu naudojamas vanduo.
5.4. Kiekvienam matavimui atliekamas tuščiasis bandymas:
5,0 ml hemoglobino tirpalo (3.7) pipete įpilama į mėgintuvėlį, mėgintuvėlis vandens vonioje (4.1) pašildomas iki 25oC, įpilama 10,0 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.4), prieš tai pašildyto iki 25oC, sumaišoma ir įpilama 1 ml 5.1 poskyryje nurodytu būdu gauto pepsino tirpalo. Sumaišoma stiklo laizdele ir mėgintuvėlis paliekamas vandens vonioje (4.1) 25oC temperatūroje lygiai 10 minučių. Sumaišoma ir filtruojama per sausą filtrą. Toliau dirbama 5.3 punkte nurodytu būdu.
5.5. Kalibracinė kreivė
1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml ir 5,0 ml tirozino standartinio tirpalo (3.8) alikvotinės dalys, kuriose yra atitinkamai 0,2 µmol, 0,4 µmol, 0,6 µmol, 0,8 µmol ir 1,0 µmol tirozino, ipilamos į 50 ml Erlenmeyer kolbas, į dar vieną kolbą įpilama to paties palyginamojo tirpalo, tik be tirozino. Tūriai kolbose druskos rūgšties tirpalu (3.1) sulyginami iki 5,0 ml. Įpilama 10,0 ml natrio hidroksido tirpalo (3.5) ir pastoviai purtant įpilama 3,0 ml praskiesto Folin-Ciocalteau reagento (3.6). Matuojamas optinis tankis, kaip nurodyta 5.3 punkto paskutiniame sakinyje. Braižoma kalibracinė kreivė, t.y. optinio tankio priklausomybė nuo tirozino koncentracijos.
6. Rezultatų skaičiavimas
Kalibracinėje kreivėje nustatomas tirozino kiekis mikromoliais, atitinkantis spalvoto tirpalo optinį tankį. Remiantis tuščiuoju mėginiu, padaroma tirozino kiekio pataisa.
Pepsino aktyvumas 25oC temperatūroje mikromoliais tirozino vienam miligramui pepsino per minutę, apskaičiuojamas pagal formulę:
 |
,
kur:
a – tirozino kiekis, gautas pagal kalibracinę kreivę, mikromoliais;
p – pagal 5.2 punktą įdėto pepsino masė, miligramais.
PASTABOS:
2. Tirpinamo pepsino kiekis turi būti toks, kad, matuojant galutinį optinį tankį, jo vertė neviršytų 0,35 ± 0,035 ribų.
3. Du vienetai vienam miligramui (2U/mg), nustatyti šiuo metodu, atitinka: 3,64 Anson milivienetų/mg [mikromoliai tirozino/(miligramui per minutę) 35,5oC temperatūroje];
arba 36400 pramoninių vienetų/g [mikromoliai tirozino/(gramui per 10 min) 35,5oC temperatūroje].
5 priedas
LAISVOjo, SUMINIO GOSIPOLIO IR CHEMIŠKAI GIMININGŲ MEDŽIAGŲ KIEKIO NUSTATYMAS
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas laisvojo gosipolio, suminio gosipolio ir chemiškai giminingų medžiagų kiekis medvilnės sėklose, sėklų miltuose ir išspaudose bei kombinuotuose pašaruose, kuriuose šių medžiagų yra daugiau kaip 20 mg/kg.
2. Metodo esmė
Gosipolis ekstrahuojamas 2-propanolio ir heksano mišiniu, esant 3-amino-1-propanoliui, kai reikia nustatyti laisvąjį gosipolį, arba dimetilformamidu – suminiam gosipolio kiekiui nustatyti. Anilinu veikiamas gosipolis paverčiamas gosipoldianilinu, kurio tirpalo optinis tankis matuojamas esant 440 nm ilgio bangai.
3. Reagentai:
3.1. 2-propanolio ir heksano mišinys: sumaišoma 60 tūrio dalių 2-propanolio a. r. ir 40 tūrio dalių n-heksano;
3.2. tirpiklis A: į 1 litro matavimo kolbą įpilama maždaug 500 ml 2-propanolio ir heksano mišinio (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanolio, 8 ml ledinės acto rūgšties ir 50 ml vandens. Praskiedžiama iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu. Šis reagentas patvarus vieną savaitę;
3.3. tirpiklis B: 2 ml 3-amino-1-propanolio ir 10 ml ledinės acto rūgšties pipete įpilama į 100 ml matavimo kolbą. Atšaldoma iki kambario temperatūros ir praskiedžiama iki žymės dimetilformamidu. Šis reagentas patvarus vieną savaitę;
3.4. anilinas, a. r.: Jei tuščiojo bandymo metu optinis tankis yra didesnis kaip 0,022, anilinas distiliuojamas su cinko milteliais, išpilant pirmąją ir paskutiniąją 10 % tūrio distiliato frakcijas. Laikomas šaldytuve užkimštame rudo stiklo butelyje, reagentas išsilaiko keletą mėnesių;
3.5. standartinis gosipolio tirpalas A: 27,9 mg gosipolio acetato suberiama į 250 ml matavimo kolbą. Druska ištirpinama ir tirpalas praskiedžiamas iki žymės tirpikliu A (3.2). 50 ml šio tirpalo pipete paimama į 250 ml matavimo kolbą ir praskiedžiama tirpikliu A iki žymės. Gosipolio koncentracija šiame tirpale yra lygi 0,02 mg/ml. Prieš naudojant tirpalas paliekamas stovėti kambario temperatūroje vieną valandą;
3. standartinis gosipolio tirpalas B: 27,9 mg gosipolio acetato suberiama į 50 ml matavimo kolbą. Druska ištirpinama ir tirpalas praskiedžiamas iki žymės tirpikliu B (3.3). Gosipolio koncentracija šiame tirpale yra lygi 0,5 mg/ml.
Standartiniai gosipolio tirpalai A ir B patvarūs 24 valandas, jei yra apsaugoti nuo šviesos.
5. Matavimas:
5.1. Mėginys
Mėginio masė priklauso nuo numatomo gosipolio kiekio jame. Geriausiai dirbti su maža mėginio mase ir palyginus didele alikvotine filtrato dalimi, kurioje esančio gosipolio kiekio užtektų, kad fotometrinis matavimas būtų tikslus. Laisvajam gosipoliui, esančiam medvilnės sėklose, medvilnės sėklų miltuose ir išspaudose, nustatyti mėginio masė neturi viršyti 1 g; kombinuotųjų pašarų mėginio masė gali būti iki 5 g. Daugeliui atvejų pakanka 10 ml tūrio alikvotinės filtrato dalies, joje turėtų būti 50 µg -100 µg gosipolio. Suminio gosipolio kiekiui nustatyti mėginio masė turi būti 0,5 g-5,0 g, kitaip tariant, kad 2 ml tūrio alikvotinėje tirpalo dalyje būtų 40 µg -200 µg gosipolio.
Cheminė analizė turi būti atliekama patalpoje, kurios temperatūra apie 20oC.
5.2. Laisvojo gosipolio nustatymas:
Mėginys supilamas į šlifo kamščiu užkemšamą 250 ml tūrio kolbą, kurios dugnas išklotas stiklo duženomis. Pipete įpilama 50 ml tirpiklio A (3.2), kolba užkemšama ir maišoma vieną valandą maišytuve. Filtruojama per sausą filtrą ir filtratas surenkamas į mažą šlifo kamščiu užkemšamą kolbą. Filtruojant filtro piltuvas uždengiamas laikrodžio stiklu. To paties filtrato alikvotinės dalys, turinčios 50 µg–100 µg gosipolio, ipilamos į dvi 25 ml matavimo kolbas (A ir B). Prireikus iki 10 ml tūrio praskiedžiama tirpikliu A (3.2). Kolbų turinys praskiedžiamas iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1). Šis tirpalas naudojamas kaip palyginamasis, pagal kurį matuojamas mėginio tirpalo optinis tankis.
Į dvi kitas 25 ml matavimo kolbas (C ir D) pipete įpilama 10 ml tirpiklio A (3.2). Kolbos (C) turinys praskiedžiamas iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1). Šis tirpalas yra palyginamasis, pagal kurį matuojamas tuščiajame mėginyje naudojamas tirpalas.
Į kiekvieną kolbą (D) ir (B) įpilama po 2 ml anilino (3.4). Spalvai išryškinti kolbos 30 minučių šildomos verdančio vandens vonioje. Ataušinama iki kambario temperatūros, turinys praskiedžiamas iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1), tirpalas sumaišomas ir kolbos paliekamos valandą stovėti.
Spektrofotometru, esant 440 nm bangos ilgiui ir naudojant 1 cm storio kiuvetes, matuojamas tuščiajame bandyme naudoto tirpalo (D) optinis tankis, lyginant jį su palyginamuoju tirpalu (C), ir mėginio tirpalo (B) optinis tankis, lyginant jį su palyginamuoju tirpalu (A).
Iš mėginio tirpalo optinio tankio vertės atimama tuščiojo bandymo tirpalo optinio tankio vertė (pataisytasis optinis tankis). Pagal šią vertę, kaip nurodyta 6 punkte, apskaičiuojamas gosipolio kiekis mėginyje.
5.3. Suminio gosipolio kiekio nustatymas:
Mėginys, kuriame yra 1 mg–5 mg gosipolio, įdedamas į 50 ml matavimo kolbą ir įpilama 10 ml tirpiklio B (3.3). Tuo pat metu ruošiamas tuščiasis bandymas, į kitą 50 ml matavimo kolbą įpilant 10 ml tirpiklio B (3.3). Abi kolbos 30 minučių šildomos verdančio vandens vonioje. Ataušinama iki kambario temperatūros ir kiekvienos kolbos turinys praskiedžiamas iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1). Sumaišoma ir 10–15 minučių paliekama nusistovėti, tada filtruojama ir filtratai supilami į kolbas su šlifo kamščiu.
Į dvi 25 ml matavimo kolbas imama po 2 ml mėginio filtrato, o į kitas dvi 25 ml matavimo kolbas – po 2 ml tuščiajame bandyme gauto filtrato. Šių kolbų turinys skiedžiamas iki 25 ml žymės 2-popanolio ir heksano mišiniu (3.1). Gauti tirpalai bus palyginamieji tirpalai.
Į kitas dvi kolbas įpilama po 2 ml anilino (3.4). Spalvai išryškinti kolbos 30 minučių šildomos verdančio vandens vonioje. Ataušinama iki kambario temperatūros, praskiedžiama iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1), sumaišoma ir paliekama stovėti valandą.
Matuojamas optinis tankis, kaip nurodyta 5.2 punkte nustatant laisvojo gosipolio kiekį. Pagal šią vertę apskaičiuojamas suminis gosipolio kiekis, kaip nurodyta 6 punkte.
6. Rezultatų skaičiavimas:
Rezultatai gali būti skaičiuojami pagal savitąjį optinį tankį (6.1) arba naudojant kalibracinę kreivę (6.2).
6.1. Skaičiavimas pagal savitąjį optinį tankį:
Savitieji optiniai tankiai aprašytomis sąlygomis turi tokias vertes:
 |
||
 |
||
Laisvo ar suminio gosipolio kiekis mėginyje apskaičiuojamas pagal formulę:
 |
kur:
E – pataisytasis optinis tankis, kaip nurodyta 5.2 punkte;
a – alikvotinė filtrato tūrio dalis, mililitrais;
p – mėginio masė, gramais.
6.2. Skaičiavimas naudojant kalibracinę kreivę:
6.2.1. Laisvasis gosipolis:
Paruošiami du rinkiniai po penkias 25 ml matavimo kolbas. Į kiekvieną rinkinio kolbą įpilama standartinio gosipolio tirpalo (3.5) alikvotinės 2,0 ml, 4,0 ml, 6,0 ml, 8,0 ml ir 10 ml tūrio dalys. Iki 10 ml praskiedžiama su tirpikliu A (3.2). Kiekvienam rinkiniui imama dar po vieną 25 ml kolbą, į kurias įpilama tik 10 ml tirpiklio A (3.2) (tuščiasis bandymas).
Pirmojo rinkinio kolbų turinys (įskaitant kolbą tuščiajam bandymui) praskiedžiamos iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1) (palyginamasis rinkinys).
Į kiekvieną antrojo rinkinio kolbą (įskaitant kolbą tuščiajam bandymui) įpilama po 2 ml anilino (3.4). Spalvai išryškinti kolbos 30 minučių šildomos verdančio vandens vonioje. Kolbos aušinamos iki kambario temperatūros, jų turinys skiedžiamas iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1), sumaišoma ir paliekama stovėti vieną valandą (standartinis rinkinys).
Standartinio rinkinio tirpalų optinis tankis matuojamas, kaip nurodyta 5.2 punkte, lyginant su atitinkamais palyginamojo rinkinio tirpalais. Braižoma kalibracinė kreivė, atidedant tirpalų optinio tankio priklausomybę nuo gosipolio kiekio (mikrogramais);
6.2.2. Suminis gosipolis
Paruošiamos šešios 50 ml tūrio matavimo kolbos. Į pirmą kolbą įpilama 10 ml tirpiklio B (3.3), į kitas – atitinkamai 2,0 ml, 4,0 ml, 6,0 ml, 8,0 ml ir 10 ml standartinio gosipolio tirpalo B (3.6). B tirpikliu (3.3) kiekvienos kolbos turinys skiedžiamas iki 10 ml. Šildoma 30 minučių verdančio vandens vonioje. Ataušinama iki kambario temperatūros, praskiedžiama iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1) ir sumaišoma.
Po 2 ml šių tirpalų įpilama į du rinkinius po šešias 25 ml matavimo kolbas. Pirmojo rinkinio matavimo kolbų turinys skiedžiamas iki 25 ml žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1) (palyginamųjų tirpalų rinkinys).
Į kiekvieną antrojo rinkinio kolbą įpilama po 2 ml anilino (3.4). Kolbos 30 minučių šildomos verdančio vandens vonioje. Kolbos aušinamos iki kambario temperatūros, jų turinys praskiedžiamas iki žymės 2-propanolio ir heksano mišiniu (3.1), sumaišoma ir paliekama stovėti vieną valandą (standartinis rinkinys).
Standartinio rinkinio tirpalų optinis tankis matuojamas, kaip nurodyta 5.2 punkte, lyginant su atitinkamais palyginamojo rinkinio tirpalais. Braižoma kalibracinė kreivė, atidedant tirpalų optinio tankio priklausomybę nuo gosipolio kiekio (mikrogramais).
6.3. Rezultatų pakartojamumas
Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų rezultatų turi neviršyti:
15% santykine verte, kai gosipolio yra mažiau kaip 500 mg/kg;
75 mg/kg, absoliučia verte, kai gosipolio yra ne mažiau kaip 500 mg/kg ir ne daugiau kaip 750 mg/kg;
10% santykine verte, kai gosipolio yra daugiau kaip 750 mg/kg.
______________
6 priedas
TILOZINO KIEKIO NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE METODU
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas tilozino kiekis pašaruose, koncentratuose ir premiksuose, kuriuose jo yra daugiau kaip 2 mg/kg.
2. Metodo esmė
Mėginys veikiamas prieš tai iki 80 oC pašildytu fosfatiniu buferiniu tirpalu, kurio pH 8, paskui ekstrahuojamas metanoliu. Po centrifugavimo ekstraktas praskiedžiamas ir jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant tilozino difuziją agaro terpėje, kurioje pasėta Sarcina lutea. Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.
3. Mikroorganizmas: Sarcina lutea ATCC Nr. 9341:
3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas
Mėgintuvėlyje su gulsčiuoju agaru, paimtu iš mitybinės terpės (4.1), pasėjama Sarcina lutea ir nustatoma pH 7,0. Inkubuojama per naktį maždaug 35oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve, ja gulsčiasis agaras persėjamas kas mėnesį.
3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas
Bakterijos iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) surenkamos naudojant 2 ml–3 ml fiziologinio tirpalo (4.4). Šia suspensija sėjama Roux kolboje su 250 ml mitybinės terpės (4.1), kurios pH sureguliuotas iki 7,0. Inkubuojama 24 valandas 35oC temperatūroje, vėliau bakterijos surenkamos 25 ml fiziologinio tirpalo (4.4). Ši suspensija sumaišoma ir praskiedžiama tiek, kad šviesos pralaidumo koeficientas, esant 650 nm bangos ilgiui, būtų apie 75%.
Laikoma šaldytuve ši suspensija gali būti naudojama savaitę.
Išankstiniais bandymais lėkštelėse su pagrindine nustatymo terpe (4.1) nustatomas sėjamos medžiagos kiekis, kurį panaudojus esant skirtingoms tilozino koncentracijoms, susidaro didžiausios nesusiliečiančios inhibavimo zonos. Mitybinėje terpėje sėjama 48oC–50oC temperatūroje.
4. Mitybinės terpės ir reagentai:
4.1. Pagrindinė nustatymo terpė1
Gliukozė 1,0 g
Tripsino peptonas 10 g
Mėsos ekstraktas 1,5 g
Mielių ekstraktas 3,0 g
Agaras atsižvelgiant į kokybę 10 g–20 g
Distiliuotas vanduo iki 1000 ml
Pradinei kultūrai laikyti ir bakterijų suspensijai ruošti pH sureguliuojamas 7,0, prieš atliekant analizę – pH 8,0.
4.2. Fosfatinis buferinis tirpalas, pH 8
Kalio – divandenilio fosfatas KH2PO4, a. r. 0,523 g
Dikalio – vandenilio fosfatas K2HPO4, a. r. 16,730 g
Distiliuotas vanduo iki 1000 ml.
4.3. Fosfatinis buferinis tirpalas, pH 7
Kalio – divandenilio fosfatas KH2PO4, a. r. 5,5 g
Dikalio – vandenilio fosfatas K2HPO4, a. r. 13,6 g
Distiliuotas vanduo iki 1000 ml.
5. Standartiniai tirpalai
Standartinė medžiaga (4.8) tris valandas 60oC temperatūroje džiovinama vakuuminiame eksikatoriuje (slėgis 0,67 kPa). Pasveriama 10 mg–50 mg standartinės medžiagos, įdedama į matavimo kolbą, tirpinama 5 ml metanolio (4.5) ir praskiedžiama fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.3) tiek, kad tirpale tilozino bazės koncentracija būtų 1000 µg/ml.
Šį pradinį tirpalą skiedžiant mišiniu (4.7), ruošiamas standartinis darbinis tirpalas S8, kuriame tilozino bazės koncentracija 2,0 µg/ml. Nuosekliai praskiedžiant (1:1) mišiniu (4.7), paruošiami tokių koncentracijų tirpalai:
S4 1,0 µg/ml
S2 0,5 µg/ml
S1 0,25 µg/ml.
6. Ekstrahavimas
Koncentratų tyrimui imamas 10 g mėginys; premiksų ir pašarų – 20 g mėginys. Į mėginį įpilama 60 ml prieš tai pašildyto iki 80oC fosfatinio buferinio tirpalo (4.2) ir maišoma 2 minutes (buitiniu maišikliu, Ultra turrax ir t. t.).
Paliekama stovėti 10 minučių, įpilama 40 ml metanolio (4.5) ir maišoma 5 minutes. Ekstraktas centrifuguojamas ir alikvotinė ekstrakto dalis praskiedžiama mišiniu (4.7), kad būtų gauta 2 µg/ml numatomos tilozino koncentracijos tirpalas (U8). Toliau nuosekliai skiedžiant (1:1) mišiniu (4.7), ruošiami U4, U2 ir U1 koncentracijos tirpalai.
Kai kiekis mažesnis nei 10 mg/kg, ekstraktas garinamas sukamajame garintuve, esant 35oC ir likutis ištirpinamas 40% metanolio tirpale (4.6).
7. Matavimas:
7.1. Sėjimas į mitybinę terpę
Į pagrindinę nustatymo mitybinę terpę (4.1), sureguliavus pH 8,0, 48 oC–50 oC temperatūroje pasėjama bakterijų suspensija (3.2).
7.2. Lėkštelių paruošimas
Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturias standartinio tirpalo koncentracijas (S8, S4, S2 ir S1) ir 4 ekstrakto koncentracijas ((U8, U4, U2 ir U1). Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartiniai tirpalai.
Kad agaro terpėje galima būtų padaryti nors aštuonias 10 mm – 13 mm skersmens skyles, parenkamos gana didelės lėkštelės. Apskaičiuojamas sėjamos mitybinės terpės (7.1) kiekis, kurio pakaktų vienodai uždengti maždaug 2 mm storio sluoksniu. Geriausia bandymus būtų atlikti ant stiklo plokštelių, kurios turi visiškai horizontalų 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedą.
Į skyles pipete įlašinami tiksliai pamatuoti antibiotiko tirpalo tūriai, kurie, atsižvelgiant į skylės skersmenį, būtų lygūs 0,10 ml – 0,15 ml.
Kiekvienam mėginiui kiekvienos koncentracijos difuzija pakartojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas.
8. Rezultatų įvertinimas
Išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo, geriausiai projekcijos būdu. Matavimų rezultatai registruojami pusiau logaritminiame popieriuje, ihibavimo zonų skersmenį vaizduojant koncentracijos logaritmo funkcija. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės. Jei nebuvo trukdžių, šios dvi tiesės yra lygiagrečios.
Santykinio aktyvumo logaritmas skaičiuojamas pagal formulę:
 |
,
Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas.
7 priedas
VIRGINIAMICINO KIEKIO NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE METODU
1. Tikslas ir taikymo sritis
Šiuo metodu nustatomas virginiamicino kiekis pašaruose ir premiksuose. Radimo riba yra 2 mg/kg1.
2. Metodo esmė
Mėginys ekstrahuojamas „Tween 80“ tirpalu metanolyje. Ekstraktas nupilamas ar centrifuguojamas ir praskiedžiamas. Jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant virginiamicino difuziją agaro terpėje, kurioje pasėta Micrococcus luteus. Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.
3. Mikroorganizmas: Micrococcus luteus ATCC Nr. 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553):
3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas
Mėgintuvėlyje su gulščiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Micrococcus luteus. Inkubuojama 24 val. 30oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve 4oC temperatūroje. Persėjama kas 2 savaites;
3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas2
Bakterijos iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) surenkamos naudojant 2-3 ml natrio chlorido tirpalo (4.3). Šia suspensija sėjama Roux kolboje su 250 ml mitybinės terpės (4.1) ir inkubuojama 18–20 valandų 30 oC temperatūroje. Bakterijos surenkamos su 25 ml natrio chlorido tirpalo (4.3) ir sumaišoma. Ši suspensija praskiedžiama 1:10 natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas, matuojant 650 nm srityje 1 cm storio kiuvetėje, lyginant su natrio chlorido tirpalu (4.3), turi būti apie 75 %. 4oC temperatūroje laikoma ši suspensija gali būti naudojama savaitę.
4. Mitybinės terpės ir reagentai:
4.1. Mitybinė ir nustatymo terpė3
Mėsos peptonas 6,0 g
Tripsino peptonas 4,0 g
Mielių ekstraktas 3,0 g
Mėsos ekstraktas 1,5 g
Gliukozė 1,0 g
Agaras 10 g–20 g
Vanduo 1000 ml
pH (po sterilizavimo) 6,5.
4.2. Fosfatinis buferinis tirpalas, pH 6
Dikalio-vandenilio fosfatas, K2HPO4 2,0 g
Kalio-divandenilio fosfatas, KH2PO4 8,0 g
Vanduo iki 1000 ml.
4.3. Natrio chlorido tirpalas, 0,8% (m/v): vandenyje ištirpinama 8 g natrio chlorido, skiedžiama vandeniu iki 1000 ml; sterilizuojama.
4.6. 0,5 % (m/v) „Tween 80“ tirpalas metanolyje: metanolyje (4.4) ištirpinama 5 g „Tween 80“ ir skiedžiama su metanoliu (4.4) iki 1000 ml.
5. Standartiniai tirpalai
Tiksliai pasvertas standartinės medžiagos (4.7) kiekis ištirpinamas metanolyje (4.4). Skiedžiama metanoliu (4.4), kad gautame pradiniame tirpale virginiamicino būtų 1000 mg/ml.
Laikomas 4oC temperatūroje uždaroje kolboje šis tirpalas yra stabilus 5 dienas. Iš pradinio tirpalo nuosekliai praskiedžiant mišiniu (4.5) ruošiami šie tirpalai:
S8 1,0 mg/ml
S4 0,5 mg/ml
S2 0,25 mg/ml
S1 0,125 mg/ml.
6. Ekstrakto ir bandymo tirpalų paruošimas:
6.1. Ekstrahavimas:
6.1.1. Produktai, kuriuose virginiamicino yra iki 100 mg/kg
Pasveriama 50 g mėginio, įpilama 200 ml tirpalo (4.6) ir 30 minučių purtoma. Paliekama nusistoti arba centrifuguojama. Paimama 20 ml supernatanto tirpalo ir sukamajame garintuve temperatūroje, neviršijančioje 40oC, nugarinama iki 5 ml tūrio. Šis likutis skiedžiamas mišiniu (4.5), kad būtų gautas numatomas 1mg/ml virginiamicino koncentracijos tirpalas (U8).
6.1.2. Produktai, kuriuose virginiamicino kiekis didesnis nei 100 mg/kg
Pasveriama ne daugiau kaip 10 g mėginio, kuriame yra nuo 1 mg iki 50 mg virginiamicino, įpilama 100 ml tirpalo (4.6) ir purtoma 30 minučių. Paliekama nusistoti arba centrifuguojama, po to skiedžiama mišiniu (4.5), kad būtų gautas numatomas 1mg/ml virginiamicino koncentracijos tirpalas (U8).
7. Matavimas:
7.1. Sėjimas į mitybinę terpę
Į nustatymo mitybinę terpę (4.1) apytikriai 50oC temperatūroje pasėjama bakterijų suspensija (3.2). Pradiniuose terpės (4.1) bandymuose ant lėkštelių nustatomas bakterinės suspensijos kiekis, reikalingas norint gauti didžiausias ir aiškiausias inhibavimo zonas su įvairiomis virginiamicino koncentracijomis.
7.2. Lėkštelių paruošimas
Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus (U8, U4, U2 ir U1). Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartiniai tirpalai. Kad agaro terpėje būtų galima padaryti bent aštuonias 10 mm–13 mm skersmens skyles, kurių centrai nutolę mažiausiai per 30 mm, parenkamos pakankamai didelės lėkštelės. Bandymai gali būti atlikti lėkštelėse, padarytose iš stiklo plokštelės, iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu.
Į lėkšteles įpilama pagal 7.1 apsėtos terpės (4.1) tokį kiekį, kad susidarytų maždaug 2 mm storio sluoksnis (60 ml–200 mm skersmens lėkštelei). Paliekama sutirštėti horizantalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinama tiksliai išmatuoti bandymo ir standartinio tirpalų kiekiai (nuo 0,10 ml iki 0,15 ml priklausomai nuo skylės skersmens). Kiekviena koncentracija panaudojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas;
8. Rezultatų įvertinimas:
8.1. 0,1 mm tikslumu išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo. Kiekvienos koncentracijos matavimų vidurkis užrašomas pusiau logaritminiame milimetriniame popieriuje, parodant koncentracijų logaritmo priklausomybę nuo inhibavimo zonų skersmens. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta žemiau esančiame pavyzdyje: naudojantis formule nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):
(a) SL = (7S1+4S2+S4-2S8)/10
Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH) pasinaudojant formule:
(b) SH = (7S8+4S4+S2-2S1)/10.
8.2. Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią (UL) ir, didžiausią (UH) koncentraciją ekstrakte, pakeičiant aukščiau pateiktose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.
Pažymimos apskaičiuotos SL ir SH vertės tame pačiame grafike ir, sujungus jas, gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiai pažymimos ir sujungiamos UL ir UH vertės, gaunama geriausiai ekstraktą atitinkanti tiesė.
Nesant trukdžių, šios dvi tiesės yra lygiagrečios. Praktiškai tieses galima laikyti lygiagrečiomis, jei (SH–SL) ir (UH–UL) vertės nuo jų vidurkio nesiskiria daugiau kaip 10%. Jei tiesės nėra lygiagrečios, U1 ir S1 ar U8 ir S8 gali būti atmesti, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:
(a‘) SL = (5S1+2S2-S4)/6 arba (5S2+2S4-S8)/6
(b‘) SH = (5S4+2S2-S1)/6 arba (5S8+2S4-S2)/6.
Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH. Turi būti patenkinami tie patys lygiagretumo kriterijai. Faktas, kad rezultatas buvo apskaičiuotas pagal tris vertes, turi būti pažymėtas galutinėje ataskaitoje.
Kai tiesės laikomos lygiagrečiomis, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) apskaičiuojamas viena iš formulių, atsižvelgiant į tai, trys ar keturios vertės buvo naudojamos įvertinant lygiagretumą.
Keturioms vertėms:
(c) log A =
Trims vertėms:
log A =
arba
(d‘) log A =
Mėginio ekstrakto aktyvumas = atitinkamo standarto aktyvumas × A
(U8 = S8 × A).
8.3. Jei apskaičiuojama, kad santykinis aktyvumas patenka už diapazono nuo 0,5 iki 2,0 ribų, bandymas kartojamas tinkamai sureguliavus ekstrakto, o jei tai neįmanoma, standartinio tirpalo koncentracijas. Kai santykinis aktyvumas negali būti gaunamas reikalaujamų ribų, bet koks gautas rezultatas laikomas apytiksliu ir turi būti nurodytas galutinėje ataskaitoje.
Jei tiesės laikomos ne lygiagrečiomis, matavimas kartojamas. Jei lygiagretumas vis dar nepasiektas, matavimas laikomas nepatenkinamu.
Rezultatas išreiškiamas miligramais virginiamicino kilograme pašaro.
9. Pakartojamumas
Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties tyrėjo, neturi viršyti:
2 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai virginiamicino kiekis siekia iki 10 mg/kg,
20% didžiausios vertės, kai kiekiai yra nuo 10 mg/kg iki 25 mg/kg,
5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg,
10% didžiausios vertės, kai kiekiai yra per 50 mg/kg.
| SUDERINTA Nacionalinės veterinarijos laboratorijos direktorius E. Blaževičius 2000 m. birželio 20 d.
|
SUDERINTA Lietuvos gyvulininkystės instituto direktorius J. Jatkauskas 2000 m. birželio 26 d.
|
______________